Métodos de laboratorio
En el laboratorio se usan una variedad de metodologías para medir las innumerables sustancias que tienen interés en la práctica clínica. La comprensión de los métodos usados para realizar una prueba concreta nos proporciona un contexto más amplio, para poder entender los resultados. A continuación realizamos una breve descripción de algunas de las técnicas mas habituales que se citan en esta página.
Los métodos de laboratorio están basados en los principios establecidos e inherentes al análisis biológico, químico y físico y abarcan todos los aspectos de la Medicina de Laboratorio, desde medir la cantidad de colesterol presente en sangre hasta el análisis del ADN o identificar los microorganismos que causan una infección. Estos métodos son similares a las recetas de cocina, pues describen en detalle los procesos y procedimientos para medir, en las muestras biológicas, una substancia en particular. El personal del laboratorio sigue paso a paso los procesos hasta que se obtiene el resultado de la prueba.
Algunos métodos, como algunas recetas de cocina, son más complejos y laboriosos que otros, y requieren un mayor grado de conocimientos para el personal del laboratorio. A menudo, existe más de un método para medir la misma sustancia y, consecuentemente, una misma sustancia puede medirse de forma diferente en diferentes laboratorios, hecho crucial a la hora de comparar los resultados obtenidos en diferentes laboratorios.
La descripción de los métodos descritos a continuación, intenta dar una visión de los principios científicos usados y de los pasos requeridos para obtener un resultado. La explicación de los métodos y sus diferencias, se incluyen para proporcionar al paciente una mejor comprensión de las pruebas que puedan haberle realizado. No se pretende realizar una descripción exhaustiva de las metodologías disponibles, sino de aquellas que se mencionan en esta página web.
Inmunoensayos
Aspectos básicos
Las inmunoglobulinas o anticuerpos son proteínas producidas por el sistema inmunitario para reconocer, unirse y neutralizar sustancias extrañas al cuerpo (antígenos). Los inmunoensayos son pruebas basadas en la alta especificidad de unión de los anticuerpos a las sustancias que reconocen o que han inducido su producción (antígenos). Pueden utilizarse para evaluar la presencia, o medir, tanto un antígeno como un anticuerpo específico, en cualquier fluido biológico del paciente.
Si el inmunoensayo se utiliza para determinar la presencia de un anticuerpo, en sangre u otro fluido, se introduce en el análisis el antígeno contra el que actúa, entre otras sustancias. Si el anticuerpo que estamos buscando existe en la muestra, reaccionará o se unirá al antígeno de la prueba y se obtendrá un resultado positivo. Si no se produce la reacción, el resultado será negativo. Ejemplos de estas pruebas pueden ser el factor reumatoide, (identifica anticuerpos del propio paciente en la artritis reumatoide), anticuerpos contra el virus del Nilo Occidental, o los anticuerpos producidos tras una vacuna, para comprobar la eficacia de la inmunización.
Si lo utilizamos para detectar la presencia de un antígeno, tanto en sangre como en otro fluido, la prueba utiliza anticuerpos contra el antígeno de interés. En este caso la reacción del antígeno de la muestra del paciente suele compararse con una serie de patrones que contienen el antígeno a concentraciones conocidas, para poder cuantificar la cantidad de antígeno presente en la muestra del paciente. Ejemplos de estos inmunoensayos incluyen la concentración de hormonas, como la insulina o las hormonas sexuales, fármacos como los antiepilépticos (carbamazepina, fenitoína, etc..) o antibióticos, o marcadores tumorales como el antígeno carcinoembrionario (CEA), el antígeno prostático específico (PSA) o la alfa-fetoproteína.
Inmunoensayo asociado (ligado) a enzimas (ELISA)
Se trata de una variante de inmunoensayo que utiliza enzimas como marcadores, uniéndolos o bien al anticuerpo o bien al antígeno. El desarrollo posterior de la reacción enzimática propia del enzima utilizado permite medir la señal producida y compararla con la curva patrón y cuantificar la sustancia de interés en la muestra del paciente.
Para detectar o medir un anticuerpo en la sangre de un paciente se prepara una superficie o pocillo al que se une el antígeno que reconoce este anticuerpo, a continuación se añade la muestra del paciente por lo que si el anticuerpo está presente se unirá al antígeno. A continuación, se añade un anticuerpo contra el anticuerpo humano, marcado con un enzima. Si el anticuerpo con enzima se une al anticuerpo del paciente fijado, se producirá la reacción enzimática y habrá señal. Esta señal indicará la presencia del anticuerpo y además, si se compara con la señal obtenida con concentraciones conocidas del anticuerpo, se podrá cuantificar el anticuerpo del paciente.
Western blot
Se trata de un tipo de inmunoensayo que detecta proteínas específicas en suero o tejidos. Combina la electroforesis (separación de proteínas por efecto de un campo eléctrico), con la posterior transferencia de las proteínas separadas a una membrana, que después se incuba con el anticuerpo contra la proteína que queremos medir asociada a un enzima.
Se pueden analizar simultáneamente muestras de varios pacientes junto a una muestra control. La electroforesis separa las proteínas de cada muestra por tamaño y forma, dando lugar a bandas que en conjunto producen una imagen similar a los peldaños de una escalera. Las escaleras de las muestras de pacientes y de la muestra control se transfieren a una membrana y esta se incuba con el complejo anticuerpo-enzima, para detectar la presencia de la proteína objeto de estudio en los pacientes.
A menudo esta técnica se usa para detectar anticuerpos o confirmar su presencia con fines diagnósticos. Un ejemplo podría ser la detección de la enfermedad de Lyme, o confirmar la presencia de proteínas del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV). La presencia de estas proteínas se interpreta por comparación con muestras conocidas,,positivas y negativas, analizadas simultáneamente.
Diagnóstico molecular
Fluorescencia de hibridación “in situ” (FISH)
En esta técnica se utilizan anticuerpos fluorescentes para evaluar genes o secuencias de ADN en los cromosomas.
Los humanos normalmente tenemos 23 pares de cromosomas, 22 pares de cromosomas no sexuales, (denominados autosomas) y un par de cromosomas sexuales (XX en mujeres, XY en hombres). Los cromosomas están formados por ADN que constituye los genes, que a su vez, codifican la producción de proteínas en el cuerpo y determinan las características propias de cada individuo. El ADN, consiste en dos cadenas unidas en forma de doble hélice, como una escalera de caracol, en la que cada mitad de la doble hélice es complementaria de la otra.
Para una prueba de FISH, una muestra de células del paciente se fija en un cristal portaobjetos. Las muestras pueden proceder de sangre, médula ósea, liquido amniótico, o células tumorales, dependiendo de la indicación clínica. Los portaobjetos con las células del paciente se calientan para separar la doble hélice, y a continuación se añaden los marcadores fluorescentes adecuados, que consisten en fragmentos de ADN de una sola cadena complementarios a las regiones de ADN de interés, y marcados con una sustancia fluorescente. A través del microscopio electrónico los genes que se han unido a los marcadores se muestran como áreas fluorescentes, es decir, como manchas brillantes sobre un fondo oscuro.
Esta técnica puede ser utilizada para detectar la presencia de genes duplicados o amplificados, o también la falta de fragmentos de ADN (deleciones génicas), o que se han desplazado de su posición correcta (traslocaciones). Un aumento del número de cromosomas, como la trisomía 21 o síndrome de Down por ejemplo, puede diagnosticarse por esta técnica de FISH. Las secuencias de ADN de interés se detectan utilizando sondas específicas, y además pueden utilizarse varias sondas simultáneamente marcándolas con diferentes colores.
Las siguientes imágenes muestran células que han sido analizadas mediante la técnica de FISH. Son unos pocos ejemplos del uso de las técnicas de FISH.
Síndrome de Down
En la figura 1 tenemos un ejemplo de una célula de líquido amniótico, analizada mediante técnica de FISH. Esta célula se obtuvo del líquido amniótico de una mujer embarazada en la que se sospechaba que el feto podría padecer un síndrome de Down (trisomia del cromosoma 21). Las dos señales verdes corresponden al cromosoma 13, usadas como control y demuestran que la prueba funciona bien. Las 3 señales rojas demuestran la presencia de 3 copias del cromosoma 21, confirmando el diagnóstico de síndrome de Down en el feto. Los médicos y los miembros del equipo de consejo genético ayudarán a la paciente a valorar los resultados de la prueba.
Figura 1: una célula de líquido amniótico, positiva para la trisomía 21 mediante FISH (señal roja) (imagen de Mary Lowery-Nordberg, PhD).
Cáncer de mama
En la figura 2, la técnica FISH se ha utilizado para evaluar células de un tumor de mama y detectar la presencia de un gen amplificado HER2/neu (señal roja). En aproximadamente el 25 % de los tumores de mama este gen está amplificado. Las mujeres con tumores con este gen amplificado pueden ser tratadas con un fármaco (Herceptina) dirigido contra la proteína producida por este gen. Si la mujer no es positiva para la ampliación de HER-2/neu, no se beneficiaría del tratamiento con este fármaco y por tanto se utilizarán otras alternativas terapéuticas.
Figura 2: células de cáncer de mama positivas para la amplificación de Her2/neu (múltiples señales rojas). La señal verde corresponde al control, que informa de la realización correcta de la prueba (imagen de Mary Lowery-Nordberg, PhD).
Leucemia
En la figura 3 se muestra la técnica FISH, que se ha utilizado para diagnosticar la leucemia mieloide crónica (LMC). En este caso las sondas detectan los genes oncogén BCR-ABL, concretamente una alteración producida por la traslocación de un fragmento del cromosoma 22 (BCR, señal verde) con una porción del cromosoma 9 /(ABL señal roja). La señal amarilla, indica la fusión anormal de ambos genes, lo que confirma el diagnostico de LMC. En esta situación, los pacientes positivos pueden beneficiarse del tratamiento con Imatinib.
Figura 3: una célula positiva para la traslocación BCR-ABL analizada mediante FISH (señal de fusión en amarillo). La señal amarilla demuestra la fusión entre el gen BCR (fragmento del cromosoma 22 ) y el gen ABL (fragmento del cromosoma 9) (imagen de Mary Lowery-Nordberg, PhD).
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), es un método del laboratorio de biología molecular, que permite realizar muchas copias de fragmentos cortos de ADN a partir de una pequeña cantidad de material genético del paciente. Este proceso, conocido como amplificación del ADN, permite después detectar o medir genes o alteraciones de genes específicos de interés en la clínica.
La doble hélice del ADN
El ADN consiste en una cadena de doble hélice, con cuatro bases (adenina, timina, guanina y citosina), que se asocian y estabilizan mediante enlaces químicos de puentes de hidrógeno, formando una estructura similar a una escalera de caracol. Cada mitad de la hélice es complementaria de la otra. En los seres humanos la variación en la secuencia de estas bases en cada cadena de ADN es la que confiere individualidad a la carga genética de cada persona. La disposición de las bases en cada gen se utiliza para producir el ARN, que a su vez se traducirá en una proteína. Existen alrededor de 25.000 genes en el genoma humano y su expresión lleva a la producción de muchas proteínas que componen nuestro cuerpo. El ADN de otros organismos, como las bacterias y virus, está también compuesto por miles de diferentes genes que codifican sus proteínas.
Figura 4: doble hélice de ADN (imagen de National Human Genome Research Institute).
¿Cómo se realiza la reacción en cadena de la polimerasa o PCR?
La PCR se desarrolla en varios pasos o ciclos, en un instrumento llamado termociclador que aumenta o disminuye la temperatura de la mezcla de reacción (que incluye la muestra del paciente) a intervalos definidos.
- En el primer paso o ciclo de la PCR se aumenta la temperatura para separar la doble cadena de ADN en dos cadenas simples, proceso conocido como desnaturalización del ADN.
- Una vez separadas las dos cadenas, la muestra se enfría ligeramente y se añaden cebadores (primers) y se deja que estos se unan a las cadenas de ADN individuales. Los primers son secuencias cortas de bases creadas específicamente, para reconocer y unirse a la sección de ADN a amplificar, que es precisamente un fragmento del gen que se quiere identificar. Los primers se denominan “directo” e “inverso”, según la dirección en la que se copian las bases dentro de la sección de ADN.
- Una vez que los primers se han unido a la secuencia complementaria del ADN del paciente, se añade una enzima, la ADN polimerasa, que copia los fragmentos de ADN a los que se han unido los primers directos e inversos, haciendo crecer la doble hélice de ADN en ambas direcciones y formando dos nuevas hélices de la zona de interés, cada una con una cadena original y otra nueva recién sintetizada.
La ADN polimerasa utilizada procede generalmente de bacterias resistentes a altas temperaturas para que resista los ciclos de alta temperatura sin degradarse. La más utilizada es la Taq polimerasa que procede de la bacteria termues aquaticus que crece en aguas muy calientes, tales como geiseres o aguas termales. - A continuación se vuelve a aumentar la temperatura (segundo ciclo), con lo que se separan las hélices recién sintetizadas, consiguiéndose cuatro cadenas de ADN que, tras enfriar y dejar actuar a los primers y la polimerasa, generarán cuatro nuevas dobles hélices. Las cuatro cadenas generarán a su vez ocho en el siguiente ciclo y así sucesivamente.
- Con 30 o 40 ciclos sucesivos se generan millones de copias del ADN origina, lo que permite su estudio detallado o la detección de mutaciones o variantes génicas. Además con la automatización de estos procesos podemos tener resultados en unas horas.
Figura 5: reacción en cadena de la polimerasa (imagen de Darryl Leja, National Human Genome Research Institute).
¿Cómo se utiliza esta técnica?
Este método puede ser usado, por ejemplo, para detectar alteraciones en el ADN de los pacientes, asociado al cáncer, o a enfermedades congénitas, y también se utiliza para detectar el ADN de virus o bacterias, para identificar la causa de una infección.
Como ejemplos, podríamos citar las mutaciones del gen JAK2, presente en la trombocitosis, gen KRAS, la enfermedad de Lyme, el virus del papiloma humano, el citomegalovirus, la gonorrea, la clamidia, la huella digital del ADN, y otras. Una variante de la PCR conocida como PCR en tiempo real, (RT-PCR) permite obtener datos a medida que se lleva a cabo el proceso de amplificación, en lugar de esperar a su finalización. Esto reduce considerablemente el tiempo de análisis. Este método se utiliza para medir la cantidad de ADN presente en una muestra.
Amplificación del ARN con transcriptasa inversa
El método de la PCR con transcriptasa inversa, permite amplificar el ARN, el ácido nucleico de cadena simple que dirige la síntesis de proteínas, y para amplificarlo primero debemos generar el ADN del que se originó. Para ello utilizamos la enzima transcriptasa inversa, y unos primers específicos, también complementarios del ARN que queremos amplificar. Cuando el primer se une al fragmento de ARN complementario, la transcriptasa inversa lo traduce a cadena de ADN doble. Esta cadena puede a continuación ser amplificada, mediante PCR convencional, y podemos detectar en la muestra del paciente el ARN de interés. Esta técnica es especialmente útil para detectar los virus con ARN en lugar de ADN, así como la carga viral en los pacientes infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) o el virus de la hepatitis C (VHC), informando de la actividad del virus en aquel paciente.
Citometría de flujo
La citometría de flujo es un método de laboratorio que se utiliza para detectar, identificar y contar células específicas de la sangre, médula ósea, fluidos corporales, como el líquido cefalorraquídeo (LCR) o tumores. Una de las aplicaciones más comunes es para el diagnóstico de leucemia y linfoma.
Secuenciación del ADN
La secuenciación del ADN es un método de laboratorio utilizado para determinar el orden de las bases dentro del ADN. En el campo de la medicina, la secuenciación de ADN se usa para una amplia variedad de propósitos, incluido el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades. Encontrarás más información sobre este tema en el artículo sobre la secuenciación del ADN.
